· полиакриламидгел мошта акриламидним мономером, почетним материјалом за полимеризацију, катализатором и мешавином соли и пуфера заједно.
· акриламиди БИС (Н,Н'-метилен двоструки акриламид) је матрица гела у облику мономера.
· амонијум персулфат започиње процес адхезивне полимеризације.Формулација лепка захтева 10% раствор амонијум персулфата припремљеног у води.Већина информација је указивала на потребу за активном употребом.Међутим, 10% раствор се може ставити на 4℃ неколико недеља без значајног губитка активности.Допуните до 10 мл и баците када се лепак не агрегира.
Савет: Проценат одакриламиду секвенцирању лепка и протеина лепак није исто.Ако користите унапред припремљен акриламид: БИС раствор, уверите се да сте набавили праву боцу.
· ТЕМЕД (Н,Н,Н',Н'-тетраметил етилендиамин) је катализатор, у смеђој боци, стављен у фрижидер.Додајте непосредно пре сијања лепка.
· Полиакриламидна електрофореза Стакло које се користи у електрофорези треба опрати пре и после сваког пута.Након електрофорезе, исперите меком четком и крпом у врућој води са сапуном, исперите дестилованом водом и оставите да се осуши.
· влага и прашина могу изазвати шупљи полимер.Пре електрофорезе, очистите стаклену плочу средством за чишћење стакла и обришите је меком четком.Оперите дестилованом водом и добро осушите папирном марамицом.Испирање са 70% етанола пре брисања папиром помаже у чишћењу и убрзавању сушења.Додајте узорке акриламида сукцесивно: БИС, вода, пуферски раствор, амонијум персулфат, ТЕМЕД.Добро протресите и одмах сипајте.
Пре полимеризације није потребно дегазирати полиакриламид.(Акриламид се некада стављао у вакуум да би се уклонили мехурићи јер кисеоник инхибира полимеризацију.)
Хоризонтални врхови узорака тачке лепљења.
· ставите комад црног папира у доњу кутију, црну позадину да направите рупу за узорак да бисте видели јасније.
· Пуфер пун резервоара лепка, непосредно изнад колоида.
· ако ивица има светло, упалите светла, нека светлост сија колоидно.Увуците узорак у пипету.
· коришћењем уређаја за аутоматско пипетирање.
· у 10-200 му 1 течна покретна тачка се може користити у већини тачака на узорку.За веома мале рупе за узорке (мање од 10μ1), дугачка глава пипете која се користи за секвенцирање лепка је погоднија.
· пипетирање управо уроњено у узорак, удисање течности која се споро креће.Узорак може изгледати лепљиво са глицерином, а брзо пумпање може увући мехуриће ваздуха у главу пипете.
· Узорци након удисања главе за пипетирање, лагано ће померити главу течности на ивицу цеви или ће брисањем папира усисати главу течности изван капљица.Пазите да не усисавате узорак.
Ставите узорак у рупу за узорак
· Уређај за пипетирање да задржи мали притисак, учини да се узорци лагано померају преко главе течности за преливање.
· глава за пипетирање уметнута у пуфер, нешто више од отвора на тачки, одржава позитиван притисак.Врх пипете се може убацити у малу рупу.
· полако и постојано узорци излазе.Врх пипете се поставља изнад отвора за узорак и узорак ће потонути у рупу.Пустите да узорак потоне да попуни рупу за узорак уместо да гура унутра.
· након последње капи узорка са течном главом, течност ће се померити на другу ногу, полако подићи течност, померити се из пуфера
Како направити вертикално узорковање лепка?
· вертикалне рупе за узорке лепљења формиране између два комада стакла.Код веома танког лепка, глава пипете се не може ни уметнути између две стаклене плоче.Пази на глицерин!Ставите главу пипете преко отвора за узорак и узорак ће потонути у рупу.
· тачка узорка пре, обавезно ставите вертикалну тачку полипропиленског ацил гела рупа узорка је испрана.Исперите неполимеризовани акриламид и воду која се може појавити на дну рупе за узорак.Вода може учинити рупу узорка знатно мањом.Користите шприц од 25 мл или 50 мл и иглу од 18.Сипајте пуфер за електрофорезу и пажљиво исперите рупу за узорак.
· може бити тешко видети рупу узорка, али у исто време, остало је лако.Ако има вишка рупа, пуфер за узорке се може тестирати са бромофенол плавим.
Време поста: 31.03.2023