· полиакриламидГел мора бити састављен од акриламидног мономера, почетног материјала за полимеризацију, катализатора и праве мешавине соли и пуфера заједно.
· акриламиди BIS (N, N'-метилен двоструки акриламид) је мономер у облику гел матрице.
· амонијум персулфат започиње процес полимеризације лепка. Формулација лепка захтева 10% раствор амонијум персулфата припремљен у води. Већина информација указује на потребу за активном употребом. Међутим, 10% раствор се може држати на 4℃ неколико недеља без значајног губитка активности. Допуните до 10 мл и баците када лепак престане да се агрегира.
Савет: ПроценатакриламидУ секвенцирању, лепак и протеински лепак нису исти. Ако користите готови раствор акриламида:BIS, уверите се да имате праву боцу.
· ТЕМЕД (N, N, N ', N '- тетраметил етилендиамин) је катализатор, у смеђој бочици, стављен у фрижидер. Додати непосредно пре сипања лепка.
· полиакриламидна електрофореза: стакло које се користи у електрофорези треба опрати пре и после сваког пута. Након електрофорезе, оперите меком четком и крпом у врућој води са сапуном, исперите дестилованом водом и оставите да се осуши.
· Влага и прашина могу изазвати шупљи полимер. Пре електрофорезе, очистите стаклену плочу средством за чишћење стакла и обришите је меком четком. Оперите дестилованом водом и темељно осушите папирном марамицом. Испирање са 70% етанолом пре брисања папиром помаже у чишћењу и убрзавању сушења. Додајте узорке акриламида редом: BIS, воду, пуферски раствор, амонијум персулфат, TEMED. Добро промућкајте и одмах сипајте.
Није потребно дегазирати полиакриламид пре полимеризације. (Акриламид се раније стављао у вакуум да би се уклонили мехурићи јер кисеоник инхибира полимеризацију.)
Врхови за узорке хоризонталних лепљивих тачака.
· ставите комад црног папира у доњу кутију, црна позадина да бисте направили неку рупу за узорак како бисте јасније видели.
· пуфер напуњен резервоаром за лепак, одмах преко колоида.
· ако ивица има светло, укључите светла, пустите да светлост сија колоид. Увуците узорак у пипету.
· коришћење аутоматског уређаја за пипетирање.
· у 10-200 μ, 1 покретна тачка течности може се користити у већини тачака на узорку. За веома мале рупе узорка (мање од 10 μ1), дугачка глава пипете која се користи за секвенцирање лепка је практичнија.
· пипетирање само уроњено у узорак, удишући споро покретну течност. Узорак може изгледати лепљиво од глицерина, а брзо пумпање може увући мехуриће ваздуха у главу пипете.
· Након удисања узорка, пипета ће нежно померати главу течности по ивици цеви или папирним брисањем усисавати главу течности изван капљица. Пазите да не усисате узорак.
Ставите узорак у отвор за узорак
· уређај за пипетирање да би се одржао мали притисак, учините да узорци благо померају главу преливне течности.
· глава пипете уметнута у пуфер, мало више од отвора за тачке, одржава позитиван притисак. Врх пипете се може уметнути у мали отвор.
· полако и равномерно извадите узорке. Врх пипете се поставља изнад отвора за узорак, а узорак ће потонути у отвор. Пустите да узорак потоне како би се попунио отвор за узорак уместо да га гурате унутра.
· Када последња кап узорка буде са течном главом, течност ће се померити на другу ногу, полако подижући кретање течности, избацујући је из пуфера
Како направити вертикално узорковање лепка?
· вертикалне тачке лепљења рупе за узорке формиране између два комада стакла. Код веома танког лепка, глава пипете се не може ни уметнути између две стаклене плоче. Пазите на глицерин! Поставите главу пипете преко рупе за узорак и узорак ће потонути у рупу.
· Пре узимања узорка, обавезно исперите вертикалну тачку полипропиленског ацил гела док се рупа за узорак не испере. Исперите неполимеризовани акриламид и воду која се може појавити на дну рупе за узорак. Вода може значајно смањити рупу за узорак. Користите шприц од 25 мл или 50 мл и иглу калибра 18. Сипајте пуфер за електрофорезу и пажљиво исперите рупу за узорак.
· Може бити тешко видети отвор за узорак, али истовремено, остало је лако. Ако постоји вишак отвора, пуфер за узорак се може тестирати бромофенол плавим.
Време објаве: 31. март 2023.